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RNA的性質及其在分子生物學研究中的意義
發表日期:2019/7/16       點擊:181

無論是3'端還是5'端的擴增’第一輪PCR 結果應該是在預測的片段大小附近有一彌散的 DNA帶或隐約可見的條帶,甚至沒有DNA,

時不必着急,接着進行第二輪PCR會出現一條 或多條帶(圖3-11)。如果在第二輪PCR之後未 得到單一的條帶,可以考慮逐步提高退火溫度, 直至得到單一條帶。若是5'端的擴增,條帶較多 的原因也可能是由于mRNA5'端的降解,此時需 要高完整性的RNA作模闆逆轉錄。如果這還不 行,就毫不猶豫地重新設計引物進行PCR

RNA的制備和分析

1. RNA的性質及其在分子生物學研究中的意義

RNA是基因表達的中間産物,同時也是RNA病毒的遺傳物質。RNA的提 取對分子生物學的研究至關重要,純度高、完整性好的RNA可以用于Northern blot純化mRNAcDNA的合成和體外翻譯等。植物細胞内RNA主要有rRNA (80%~85%)、tRNA及小分子 RNA (15%~20%)和 mRNA (1%〜5%)。

rRNA在總RNA分子中含量豐富,由28S18S5S5.8S幾類組成,它 們之間同源性高、分子量變化不大,具有确定的大小和核苷酸序列,所以可以根 據它們的密度和分子大小,通過密度梯度離心,凝膠電泳或離子交換層析進行分 離。

mRNA與上述RNA不同,其含量為細胞總RNA1%—5%,分子種類繁 多,分子量大小和核苷酸序列各不相同,從數百至數千堿基不等。絕大多數真核 細胞mRNA分子(除血紅蛋白及有些組蛋白mRNA以外3'端均有20~250個 多聚腺核苷酸poly (A)。利用此特征,可以很方便地從總RNA中,用寡聚 (dT)親合層析法分離mRNA在物理特性上不均一的mRNA分子群體編碼細 胞内所有的多肽和蛋白質,因此mRNA是分子生物學的主要研究對象之一,它 的提取和分析就顯得非常重要,如下所示。

2. RNA分離

RNA分離的最關鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。因為RNA酶含有肽鍊 内二硫鍵,使其能抵抗長時間的煮沸和溫和變性劑,變性後也可迅速折疊,具有 很高的穩定性。該酶的活性不依賴二價陽離子激活,難以因金屬離子螯合劑 (EDTA)失活。RNA酶可耐受多種處理(例如煮沸、酸、堿)而不失活。RNase 存在廣泛,環境中的灰塵、各種實驗器皿和試劑、人體的汗液和及唾液中均存在 RNA酶。目前,尚無使RNA酶失活的簡易辦法。

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